Laser非侵入式在线检测微生物发酵振荡器的创新研发及特点_设备知识_quote

Laser非侵入式在线检测微生物发酵振荡器的创新研发及特点

Time：2017-02-21
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Introduce：　　摘要：从国内外微生物发酵振荡器存在的问题入手，介绍了Laser非侵入式在线检测微生物发酵振荡器的主要功能和性能，以及关键

　　摘要：从国内外微生物发酵振荡器存在的问题入手，介绍了Laser非侵入式在线检测微生物发酵振荡器的主要功能和性能，以及关键技术和积极的应用效果，并阐述了创新点。Laser非侵入式在线检测微生物发酵振荡器具有激光非侵入、多通道、在线实时检测检测微生物发酵的功能。

关键词：非侵入式，多通道，在线实时检测，微生物发酵，振荡器

0引言

Laser非侵入式在线检测微生物发酵振荡器能够广泛应用于温度和振荡频率可调，对光密度测定有着较高要求的细菌培养、发酵、杂交和生物化学反应，以及酶和细胞组织研究等。在医学、生物学、分子学、制药、食品等研究应用领域有着广泛而重要的应用前景。

Laser非侵入式在线检测微生物发酵振荡器把常规的震荡器功能和光密度测试仪器功能结合起来，具有以下优势：(1)取代了常规的定时手工抽样，然后在分光光度计或紫外分光光度计上测量微生物生长发酵过程中的光密度变化，用以测知浓度变化规律；(2)具备连续多通道、实时、在线、非侵入式监测功能；(3)数据采集系统设计为有线与无线数据采集、传输；(40在多道运行基础上，将设计正交试验程序，因此能满足菌种筛选、工艺优化需求。

1 Laser非侵入式在线检测微生物发酵振荡器的研发要点

1.1研究内容

(1)振动环境中，建立生物样品多道光密度实时在线监测装置，记录实验或生产中微生物增殖光密度变化；

(2)选择常用微生物菌种校正光密度，标定菌种浓度，提高装置的稳定性和数据重复性；

(3)完成有线USB接口系列设计，开发无线接口样机，为建立摇床物联网奠定基础；

(4)探索新型传感器应用，为科研和生产用开发提供技术支援，例如贴片或针形传感器应用；

(5)在多道光密度监测系统基础上，设计正交实验在线分析或离线分析软件，为满足科研和生产所需的菌种筛选和培养基筛选及试验工艺优化；

(6)在实验基础上，生成标准曲线，并用这一标准曲线作为微生物发酵的控制基准，实现重复试验或生产过程的优化控制。

1.2关键技术

一般科学测试仪器，要把防震动放在安装仪器上至关重要。而在光电监测摇床上，却要不断提升振动的频次和幅度。这就是设计的最大难点！这也所研发的关键技术，其关键技术如下：

(1)要保证Laser光源发射和接收器件的精密固定和光学准直性；

(2)锥形三角瓶，不仅起着盛装微生物发酵液体的功能，而且是光路和光学器件的一部分，消除三角瓶玻璃壁对Laser光的折射或散射，以及保证瓶内光线经过的光程的稳定性；

(3)光电检测器的线性范围既要覆盖测量所需的（0-2.5 OD）值，又要把背景光的干扰减小到误差范围之内；

(4)检测电路、数据采集和数据处理软件，要能在激烈振动环境下输出平滑数据和光滑的工作曲线。只有这样，才能准确地判别工作曲线的特征区段，制作可信的标准曲线。

1.3技术指标

光密度测量范围：0-2.5；光密度测量分辨率：OD600=1.0时,0.03；光密度测量准确率：OD600=1.0时，<0.5%；工作曲线重复性: 不小于95%；转速：0-250rpm；（无线模块）；射频传送距离: 不小于100m；单批处理量：1-12个样品。

2智能控制装置的研究

智能控制装置利用光电吸收原理，采用特制锥形三角烧瓶，不需要通过定时抽样测量方式，获得发酵液体生产条件的各种信息，实现发酵液体在线的非接触式检测，并可建立生产所需优化数学模型、绘制成标准工作曲线，为摇床用于精确研究菌体发酵的最佳生长条件带来技术突破，为精确性指导工业化发酵带来极大的便利。比如，要生产一种生物医药制品，根据研究阶段建立了一种标准曲线，作为生产控制基准，使添加、产出后的控制过程符合标准曲线的运行规律，这将提高生物医学产品生产的技术水平、自动化程度和产品质量。

2.1技术方案
(1)对现有振荡器（摇床）进行改进，便于与Laser非侵入式在线监测微生物发酵振荡器的核心装置组合；
　　(2)在振荡器（摇床）设备上，装置由Laser光源发射器、液体发酵用的玻璃三角瓶（相当于分光光度计用的比色皿）、投射光接收器组成的Laser非侵入式在线监测微生物发酵振荡器的光学系统及测量电路和固定件；
(3)根据前期研究结果，设计了非接触式在线检测发酵振荡器的光密度检测系统（如图1），每一个关键细节，都是为了消除振动环境对测量数据的干扰；
(4)如果采用高灵敏的光学检测元件，就要将三角摇瓶的瓶壁全部涂上黑色涂层，只保留Laser光线进出孔的透明，其好处是为检测微生物荧光，预留研究条件。但是，多数允许使用线性范围宽的光电检测元件用大功率Laser光源（>50mW）,其优点是把背景光的干扰降低到误差之内，这样做，无需严格的避光装置；
(5)所有光学器件、三角瓶、前置电路和固定件，都要安放在一体化的硅胶架或金属架上，保证光路的准直效果和器件固定的坚固；
(6)实验时，将微生物发酵液（各种培养基的混合物）放入三角瓶（摇瓶），开启振荡器和Laser光源，测量未发酵前微生物发酵液的透光度，和吸光度（按比尔定律计算），这相当于分光光度仪的满度校正。随着三角瓶内生物菌体数量逐渐增多，发酵液体浓度增大，使透过的光发生变化，光接收电极接收的电信号数值也随之发生变化，从而判定三角瓶内发酵液菌体的生长程度。在硬件和软件上，保证所测数据的平滑性和微生物生长曲线的光滑性。只有这样，才能实时地，通过数学上的微分或二次微分准确确定实验过程的特征区段；
(7)在Laser非侵入式在线监测微生物发酵振荡器的多通道测量系统中，将1-12个通道数据存入.TXT Data文件和Excel数据库文件。前者，用于后续数据处理或其他高级语言用户使用，例如生成标准曲线，双光路校正等；后者，用于实验操作人员个性化数据处理，例如撰写实验报告或论文。一般，使用9个通道试验数据，就可以实现正交试验，实现菌种筛选和实验条件优化。在这一阶段，要与用户协调合作。
(8)在本项目中，安排新型传感器的应用研究，采用国际上先进的非接触pH、溶氧和二氧化碳传感器的应用研究，为提升微生物发酵检测和控制技术，做出应有的贡献。并与用户合作，扩大光源光谱范围，例如发射光源采用滤光片或光栅，使光源覆盖红外光到紫外。
2.2方案优点
(1)与传统的手工定时抽样，分光光度计测试吸光度或各种细胞计数形式相比，它实现了科研、教学和生产设备现代化——用最新的计算机技术、互联网和无线物联网技术，实现微生物发酵实验和生产工艺的智能化；
(2)与其他新开发的pH辅料摇床相比，实现了传感器与被测微生物发酵液的非接触，不易带来杂散细菌干扰或病菌侵入，提高微生物发酵工艺的质量；
(3)无论采用高灵敏检测器，使用涂层遮光三角瓶，还是采用线性范围宽的检测器，尽可能减少背景光干扰的装置，都能连续记录微生物发酵过程，绘制工作曲线，标定特定发酵区段，提供菌种增殖最快速度和菌种生长饱和参数等，为正交试验做准备；
(4)在使用高灵敏检测器件设计系统时，需要黑色涂层遮光性好，可避免衍射光线干扰的特制锥形三角瓶与传统玻璃三角烧瓶相比，其特点：首先，能保证光电检测精度；其次，用镀鉻材料涂层遮光，三角瓶温度传导性好，为开发底部变温摇床托盘提供条件。在使用线性宽的检测器设计系统时，锥心三角瓶的底部有15 mm左右的圆柱体，它不会导致激发光源被瓶壁散射，保证光程范围内的聚焦性，而检测用的光敏元件表面积为10 mm×10 mm，期间窗口光谱处于红光区，因此有效阻止了背景光的干扰。对于出口产品，可以使用窄带滤光的光电检测器件，其价格几十倍于现用器件，但相对于出口产品的质量要求，是必须的；
(5)硅胶固定架有弹性，坚固耐用，不仅防止三角瓶位移与脱落，还可以内置电器件；
(6)通过重复试验绘制微生物增殖曲线，根据重复微生物发酵实验，生成标准曲线（一般需要5人，5次以上重复实验，才能生成特定培养基和特定物理化学下的标准曲线）。在工业化生产时，可以根据标准曲线控制工业大罐发酵的工艺程序。可以说，它是通过模糊控制原理，去控制设备添加原料，保证后续工艺，按标准曲线引导进行；
(7)按标准曲线实现工艺控制，不需要取样检测更多化学物理参数，即可获得发酵条件及相关信息，特别是可提供摇床发酵正交实验设计，提供精确实验参数，提高科研效率。

3应用效果

3.1 在线监测与数据分析

在微生物发酵实验中，为了获得菌体生长规律，一般定时将振荡器停机（例如1次/h），手工抽取发酵液，在分光光度计上测量液体的吸光度（A 或称光密度 OD值），根据比尔定律，校正为浓度，有时，用细胞计数器计数菌体数目。但是，这种侵入式，手工测量，速度慢；对微生物又会引入污染源；为多保留样品，取样次数有限，获得数据有限；操作和数据处理麻烦；

而使用本研制产品，不需关、停振荡器，可连续、在线监测发酵液体吸光度，实验人员无需现场监视，就能获得多通道发酵液体的浓度变化规律；用户不需修正，就能用平滑数据和光滑图形撰写实验报告和论文；整个实验过，发酵液不与外界接触，所以没有杂菌污染和细菌侵害。

3.2 标准曲线监测程序控制发酵

常规振荡器为机械式控制发酵，如控制温度、转数（容解氧）等，而标准曲线监程序控制发酵则是以工艺优化的标准曲线控制和监测生产发酵，所得到的生产曲线与标准曲线重合性达到99.5%。

优化工艺标准曲线的制备：以果香型酵母菌（Au2918黑龙江省微生物所）果酒发酵工艺为例：首先，在摇床上经过无数次试验得出，某种果浸汁，调整糖度不低于8%，pH4.5，灭菌、冷却、接种（5%）；0~48h内温度21~23±1.0℃，通气量1:1.5，糖度5%，pH4.3；48~72h，20~22±1.0℃，通气量1:1.0，糖度3%，pH4.1；72~120h，19~21±1.0℃，通气量1:0.5，糖度1%，pH4.0；（其中调pH、加糖等略）；120h~20d，16~18±0.5℃，通气量1:0.0，糖度0.5%，pH4.0，CO2压力MPa=0~0.5，酒精度3~5%。以上为发酵阶段,以后进行陈酿阶段。发酵阶段的每一时刻都可以对应一个光吸收值，并且这个值比较稳定，通过100 次试验，出现重复的次数可达99.5次。由时间与光吸收值绘制曲线定为优化工艺的标准工作曲线，由标准曲线时时监测生产曲线并编辑生产控制程序，如控温，控制通气量，加糖，调酸等。如果曲线重合性达到99.5，则产品质量可信度也达到了99.5。这对指导生产意义十分重大，但目前发酵行业尚无先例。

3.3 物联网远程监控

物联网远程监控如图2所示。通过无线数据采集和数据传输模块，不仅可以将数据传送到上位机，而且可以通过NET互联网出送到需要数据的任何地方，使专业人员可在任何时候获得在线发酵情况，有利于及时采取相应措施。

图2 物联网远程监控

3.4 集中控制发酵

　　(1)用于制备标准工作曲线，若有10台（每台9只）同时工作，获得标准曲线只需要重复三批次（取平均值），人为操作误差几乎为零；否则用一台设备需要重复操作300次（取平均值），而人为出现误差的概率会更高；

　　(2)标准图谱控制程序可以复制到多台振荡器上，同时监测多台设备进行工作，可快速获得批量同类产品。

3.5 建立发酵图谱

　　生产稳定性与可重复性是建立该菌图谱的必要技术条件，可应用于很多方面：

3.5.1强势菌种筛选

　　硬件依托本多道测试系统，软件是建立在特征区段识别和正交试验计算程序之上的。以Au2918为例，果酒发酵阶段对产品质量影响占60%，陈酿占30%，果品占10%（葡萄酒）；如果改变生产工艺中的某些条件，加大葡萄酵母菌代谢难度，有利于提高果酒的质量；如，发酵的每个阶段温度只降低2±1.0℃，而最后酒精度仍然达到3~5%，则该菌株完全优于原有的Au2918，实际生产中，这种情况时有发生。

3.5.2筛选鉴别菌株

　　将九种同类菌株，置于特定的标准曲线培养液的三角瓶中，最后只有两瓶生产曲线与标准曲线一致，拟合度达到99.5,表明该批次中有两个菌株型号是Au2918。另外七瓶还要用图谱中的其他培养进行发酵,并与电脑预存的标准曲线进行比对,直到全部找出来为止。

3.5.3控制工业生产发酵

　　将大发酵罐侧面设计出一个玻璃支管，用于进行Laser光检测，绘制生产曲线，并与电脑预存工本曲线时时进行比对，出现工艺参灵敏报警时，采取相应生产处理。

3.6 数据采集与传输

　　构建多通道无线数据传输系统，实现对动态运动中的样品相关监测信号与微电脑信息处理中心之间的无线传输。

3.7 动态曲线系统的建立

　　动态监测并实时显示微生物发酵工作曲线，特征点识别和标记，为用户建立数学模型提供技术支持。

4产品的创新性

4.1 技术创新

　　（1）目前常规的监测技术大多为定时抽样监测，这需要人为定时地借助于分光光度计抽样测量，不但费时费力，而且容易造成发酵液杂菌污染废弃掉，浪费材料资源。

　　本产品则是动态环境中测量处理微生物生长发酵过程中光密度（可校正为浓度）变化情况，完全是系统对数据和结果自动处理，省去人为手工操作，大大提高工作效率。

　　（2）目前常规的监测方式大多为从摇床上抽取发酵液，利用在分光光度计进行测量光密度，是一种单通道的监测方式，由于定时选取数个关键点抽样，测得数据需要借助计算机软件处理得到工作曲线，这样获得的曲线只能是趋近于客观的微生物生长发酵曲线。

　　本产品采用多通道（1-12）、连续实时在线非侵入式监测微生物整个生长发酵过程，可以8组样品同时进行测量，大大提高了工作效率；数据采集和曲线的绘制同时进行，可以让研究人员时刻掌握生长发酵全过程光密度变化情况；最后完成对数据和工作曲线的自动数据库存储，避免由于人为疏忽等情况造成数据丢失。

　　（3）系统选用24位专用智能数据采集模块，将数据转换为数字量，然后通过USB接口传送至计算机，进行数据平滑、计算、绘图、数据库存储或网上传递。数据采集系统设计为有线与无线数据采集、传输两种，实际工作中依需要进行选择。同时，可进一步构建无线物联网的自动化群控设备。

4.2 结构创新

　　为了保证微生物在生长发酵过程中的溶氧量，只能在瓶内加入少量的培养液（30%以内）。这样就存在如下问题：为了测定培养液的光密度（OD600或OD660），就必须将激光光束的水平位置放得很低，正好穿过三角瓶倒角曲面，此曲面对光线的折射使聚焦的激光束散焦。散焦后的光束又会因为培养液在摇床上激烈晃动，时而使光束露出液面改变激发光光程，时而激发光光束会被摇晃中的液面反射或散射，干扰准确测量光密度。

　　为此，本项目设计了一种新型三角瓶。图3 为常规三角瓶与改进后的三角瓶的比较。

　　其结构创新方案为：把三角瓶底部做成倒角极小的圆柱体，250 mL容量的三角圆瓶柱体高度为13 mm，激光束水平位置处于离底部10 mm高度，其余部分按常规三角瓶设计。

　　通过此结构创新，有效避免了三角瓶曲面对光线的折射使聚焦的激光束散焦而干扰测量准确度的问题。

4.3主要指标创新

　　研发的Laser非侵入式在线检测微生物发酵振荡器主要指标如下：光密度测量范围：0-2.5；光密度测量分辨率：OD600=1.0时,0.03；光密度测量准确率：OD600=1.0时，<0.5%；工作曲线重复性: 不小于95%；转速：0-250rpm；（无线模块）射频传送距离: 不小于100m；单批处理量：1-8个样品。

图3 常规三角瓶与改进后的三角瓶

5结语

　　创新研发的 Laser非侵入式在线检测微生物发酵振荡器本身有利于提升科研水平与科研质量，产品能够提供给大量高校、研究所应用。所以，产品可应用于生物工程、医学、制药、分子学、食品等领域。

　　本产品的研发属依靠本地资源，自主研发，对于产品设计和工艺开发拥有自主知识产权，有利于实现技术产业化，提升我国行业技术在世界上的地位，有利于提高我国综合国力。

参考文选：

原著：严广号，沈水兴，胡裕杰. Laser非侵入式在线检测微生物发酵振荡器的创新研发及特点[J].制药装备.总137期.2017（01)

作者简介：严广号，沈水兴，胡裕杰.上海智城分析仪器制造有限公司，上海 201400

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